Ein SARS-ähnlicher Cluster zirkulierender Fledermaus-Coronaviren zeigt Potenzial für die Entstehung des Menschen
Ein SARS-ähnlicher Cluster zirkulierender Fledermaus-Coronaviren zeigt Potenzial für die Entstehung des Menschen
Naturmedizin Veröffentlicht: 09 November 2015
Ein SARS-ähnlicher Cluster zirkulierender Fledermaus-Coronaviren zeigt Potenzial für die Entstehung des Menschen
Vineet D Menachery , Boyd L Yount Jr , Kari Debbink , Sudhakar Agnihothram , Lisa E. Gralinski , Jessica A Plante , Rachel L. Graham , Trevor Scobey , Xing-Yi Ge , Eric F. Donaldson , Scott H Randell , Antonio Lanzavecchia , Wayne A Marasco , Zhengli-Li Shi & Ralph S Baric
Nature Medicine Band 21 , Seiten 1508–1513 ( 2015 ) Diesen Artikel zitieren
30. März 2020 Anmerkung der Redaktion, März 2020: Uns ist bewusst, dass dieser Artikel als Grundlage für ungeprüfte Theorien verwendet wird, dass das neuartige Coronavirus, das COVID-19 verursacht, konstruiert wurde. Es gibt keine Beweise dafür, dass dies wahr ist; Wissenschaftler glauben, dass ein Tier die wahrscheinlichste Quelle des Coronavirus ist.
Eine Autorenkorrektur zu diesem Artikel wurde am 22. Mai 2020 veröffentlicht
Ein Corrigendum zu diesem Artikel wurde am 06. April 2016 veröffentlicht
Das Auftreten des schweren akuten respiratorischen Syndrom-Coronavirus (SARS-CoV) und des Middle East Respiratory Syndroms (MERS)-CoV unterstreicht die Bedrohung durch speziesübergreifende Übertragungen, die zu Ausbrüchen beim Menschen führen. Hier untersuchen wir das Krankheitspotenzial eines SARS-ähnlichen Virus, SHC014-CoV, das derzeit in chinesischen Hufeisennasenpopulationen zirkuliert 1 . Mit dem SARS-CoV-Reverse-Genetik-System 2 haben wir ein chimäres Virus erzeugt und charakterisiert, das die Spitze des Fledermaus-Coronavirus SHC014 in einem Maus-adaptierten SARS-CoV-Rückgrat exprimiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Viren der Gruppe 2b, die den SHC014-Spike in einem Wildtyp-Rückgrat kodieren, mehrere Orthologe des humanen Angiotensin-Converting-Enzyms II (ACE2) des SARS-Rezeptors effizient nutzen, effizient in primären menschlichen Atemwegszellen replizieren und in vitro- Titer erreichen können, die epidemischen Stämme von SARS-CoV. Darüber hinaus zeigen in-vivo- Experimente die Replikation des chimären Virus in der Mauslunge mit bemerkenswerter Pathogenese. Die Bewertung der verfügbaren SARS-basierten immuntherapeutischen und prophylaktischen Modalitäten ergab eine schlechte Wirksamkeit; Sowohl monoklonale Antikörper- als auch Impfstoffansätze konnten unter Verwendung des neuartigen Spike-Proteins nicht neutralisieren und vor Infektionen mit CoVs schützen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben wir ein infektiöses rekombinantes Virus in voller Länge SHC014 synthetisch neu abgeleitet und eine robuste Virusreplikation sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen . Unsere Arbeit deutet auf ein potenzielles Risiko des Wiederauftretens von SARS-CoV durch Viren hin, die derzeit in Fledermauspopulationen zirkulieren.
Das Aufkommen von SARS-CoV läutete eine neue Ära in der artenübergreifenden Übertragung schwerer Atemwegserkrankungen ein, wobei die Globalisierung zu einer schnellen Verbreitung auf der ganzen Welt und massiven wirtschaftlichen Auswirkungen führte 3 , 4 . Seitdem sind mehrere Stämme – darunter die Influenza-A-Stämme H5N1, H1N1 und H7N9 sowie MERS-CoV – aus Tierpopulationen hervorgegangen, die in den betroffenen Regionen erhebliche Krankheiten, Sterblichkeit und wirtschaftliche Not verursachen 5 . Obwohl Maßnahmen des öffentlichen Gesundheitswesens den SARS-CoV-Ausbruch stoppen konnten 4 , haben jüngste Metagenomik-Studien Sequenzen von eng verwandten SARS-ähnlichen Viren identifiziert, die in chinesischen Fledermauspopulationen zirkulieren und eine zukünftige Bedrohung darstellen könnten 1 , 6 . Sequenzdaten allein liefern jedoch nur minimale Erkenntnisse, um zukünftige präpandemische Viren zu identifizieren und sich darauf vorzubereiten. Um das Emergenzpotenzial (d. h. das Potenzial, Menschen zu infizieren) von zirkulierenden Fledermaus-CoVs zu untersuchen, haben wir daher ein chimäres Virus entwickelt, das für ein neuartiges, zoonotisches CoV-Spike-Protein kodiert – aus der RsSHC014-CoV-Sequenz, die aus chinesischen Hufeisennasenfledermäusen isoliert wurde 1 —im Kontext des SARS-CoV-Maus-adaptierten Rückgrats. Das Hybridvirus ermöglichte es uns, die Fähigkeit des neuartigen Spike-Proteins zu bewerten, Krankheiten unabhängig von anderen notwendigen adaptiven Mutationen in seinem natürlichen Rückgrat zu verursachen. Mit diesem Ansatz haben wir die durch das SHC014-Spike-Protein vermittelte CoV-Infektion in primären menschlichen Atemwegszellen und charakterisiert in vivo und die Wirksamkeit verfügbarer Immuntherapeutika gegen SHC014-CoV getestet. Zusammen übersetzt die Strategie Metagenomikdaten, um bei der Vorhersage und Vorbereitung auf zukünftige auftretende Viren zu helfen.
Die Sequenzen von SHC014 und dem verwandten RsWIV1-CoV zeigen, dass diese CoVs die nächsten Verwandten der epidemischen SARS-CoV-Stämme sind ( Abb. 1a,b ); Es gibt jedoch wichtige Unterschiede bei den 14 Resten, die menschliches ACE2, den Rezeptor für SARS-CoV, binden, einschließlich der fünf, die für den Wirtsbereich kritisch sind: Y442, L472, N479, T487 und Y491 (Ref. 7 ). In WIV1 unterscheiden sich drei dieser Reste vom epidemischen SARS-CoV-Urbani-Stamm, aber es wurde nicht erwartet, dass sie die Bindung an ACE2 verändern ( Ergänzende Abb. 1a, b und Ergänzungstabelle 1 ). Diese Tatsache wird sowohl durch Pseudotypisierungsexperimente bestätigt, bei denen die Fähigkeit von Lentiviren, die WIV1-Spike-Proteine kodieren, in Zellen einzudringen, die humanes ACE2 exprimieren ( Ergänzende Fig. 1 ), als auch durch in vitro- Replikationsassays von WIV1-CoV (Ref. 1 ) bestätigt. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich 7 von 14 ACE2-Interaktionsresten in SHC014 von denen in SARS-CoV, einschließlich aller fünf für den Wirtsbereich kritischen Reste ( Ergänzende Abb. 1c und ergänzende Tabelle 1 ). Diese Veränderungen, gekoppelt mit dem Versagen pseudotypisierter Lentiviren, die den SHC014-Spike exprimieren, in Zellen einzudringen ( Ergänzende Fig. 1d ), legten nahe, dass der SHC014-Spike nicht in der Lage ist, humanes ACE2 zu binden. Es wurde jedoch von ähnlichen Veränderungen bei verwandten SARS-CoV-Stämmen berichtet, die eine ACE2-Bindung ermöglichen 7 , 8 , was darauf hindeutet, dass zur Verifizierung zusätzliche Funktionstests erforderlich waren. Daher synthetisierten wir den SHC014-Spike im Kontext des replikationskompetenten, Maus-adaptierten SARS-CoV-Rückgrats (wir bezeichnen das chimäre CoV im Folgenden als SHC014-MA15), um die Möglichkeit für Pathogenese- und Impfstoffstudien an Mäusen zu maximieren ( Ergänzende Abb 2a ). Trotz Vorhersagen sowohl aus strukturbasierten Modellierungs- als auch Pseudotypisierungsexperimenten war SHC014-MA15 lebensfähig und wurde in Vero-Zellen zu hohen Titern repliziert ( Ergänzende Fig. 2b ). Ähnlich wie SARS benötigte auch SHC014-MA15 ein funktionsfähiges ACE2-Molekül für den Eintritt und könnte ACE2-Orthologe von Mensch, Zibet und Fledermaus verwenden ( Ergänzende Abb. 2c,d ). Um die Fähigkeit des SHC014-Spikes zu testen, eine Infektion der menschlichen Atemwege zu vermitteln, untersuchten wir die Empfindlichkeit der menschlichen epithelialen Atemwegszelllinie Calu-3 2B4 (Ref. 9 ) gegenüber einer Infektion und fanden eine robuste SHC014-MA15-Replikation, vergleichbar mit der von SARS-CoV Urbani ( Abb. 1c ). Um diese Ergebnisse zu erweitern, wurden primäre humane Atemwegsepithel (HAE)-Kulturen infiziert und zeigten eine robuste Replikation beider Viren ( 1d ). Zusammen bestätigen die Daten die Fähigkeit von Viren mit dem SHC014-Spike, menschliche Atemwegszellen zu infizieren und unterstreichen die potenzielle Bedrohung einer artenübergreifenden Übertragung von SHC014-CoV.
Abbildung 1: SARS-ähnliche Viren replizieren in menschlichen Atemwegszellen und produzieren in vivo Pathogenese.
( a ) Die vollständigen Genomsequenzen repräsentativer CoVs wurden ausgerichtet und phylogenetisch kartiert, wie in den Online- Methoden beschrieben . Der Maßstabsbalken stellt Nukleotid-Substitutionen dar, wobei nur Bootstrap-Unterstützung über 70 % markiert ist. Der Baum zeigt CoVs, die in drei verschiedene phylogenetische Gruppen unterteilt sind, definiert als α-CoVs, β-CoVs und γ-CoVs. Klassische Untergruppencluster sind mit 2a, 2b, 2c und 2d für die β-CoVs und mit 1a und 1b für die α-CoVs gekennzeichnet. ( b ) Aminosäuresequenzen der S1-Domänen der Spikes von repräsentativen β-CoVs der 2b-Gruppe, einschließlich SARS-CoV, wurden ausgerichtet und phylogenetisch kartiert. Der Maßstabsbalken repräsentiert Aminosäuresubstitutionen. ( c , d ) Virale Replikation von SARS-CoV Urbani (schwarz) und SHC014-MA15 (grün) nach Infektion von Calu-3 2B4-Zellen ( c ) oder gut differenzierten, primären HAE-Zellkulturen mit Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ( d ) at eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 für beide Zelltypen. Proben wurden zu einzelnen Zeitpunkten mit biologischen Replikaten ( gesammelt n = 3) sowohl für Calu-3- als auch für HAE-Experimente . ( e , f ) Gewichtsverlust ( n = 9 für SARS-CoV MA15; n = 16 für SHC014-MA15) ( e ) und Virusreplikation in der Lunge ( n = 3 für SARS-CoV MA15; n = 4 für SHC014- MA15) ( f ) von 10 Wochen alten BALB/c-Mäusen, die mit 1 × 10 4 pfu Maus-adaptiertem SARS-CoV MA15 (schwarz) oder SHC014-MA15 (grün) über den intranasalen (in) Weg infiziert wurden. ( g, h ) Repräsentative Bilder von Lungenschnitten gefärbt für SARS-CoV N-Antigen von Mäusen, die mit SARS-CoV MA15 ( infiziert waren n = 3 Mäuse) ( g ) oder SHC014-MA15 ( n = 4 Mäuse) ( h ) . Für jedes Diagramm stellt der Mittelwert den Gruppenmittelwert dar, und die Fehlerbalken definieren die Sem-Skalierungsbalken, 1 mm.
Um die Rolle des SHC014-Spikes bei der Vermittlung einer Infektion zu bewerten in vivo , infizierten wir 10 Wochen alte BALB/c-Mäuse mit 10 4 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) von entweder SARS-MA15 oder SHC014-MA15 ( Abb. 1e–h .). ). Mit SARS-MA15 infizierte Tiere erfuhren 4 Tage nach der Infektion (dpi) einen schnellen Gewichtsverlust und eine Letalität; im Gegensatz dazu führte eine SHC014-MA15-Infektion zu einem beträchtlichen Gewichtsverlust (10 %) aber keiner Letalität bei Mäusen ( 1e ). Die Untersuchung der Virusreplikation ergab nahezu äquivalente Virustiter aus den Lungen von Mäusen, die mit SARS-MA15 oder SHC014-MA15 infiziert waren ( 1f ). Während die Lungen von SARS-MA15-infizierten Mäusen eine robuste Färbung sowohl in den terminalen Bronchiolen als auch im Lungenparenchym 2 dpi ( Abb. 1g ) zeigten, zeigten die von SHC014-MA15-infizierten Mäusen eine reduzierte Antigenfärbung der Atemwege ( Abb. 1h ); im Gegensatz dazu wurde im Parenchym oder in der histologischen Gesamtbewertung kein Defizit bei der Antigenfärbung beobachtet, was auf eine unterschiedliche Infektion des Lungengewebes für SHC014-MA15 hindeutet ( Ergänzende Tabelle 2 ). Als nächstes analysierten wir die Infektion bei anfälligeren, gealterten (12 Monate alten) Tieren. SARS-MA15-infizierte Tiere verloren schnell an Gewicht und erlagen einer Infektion ( Ergänzende Abb. 3a,b ). Die SHC014-MA15-Infektion führte zu einem starken und anhaltenden Gewichtsverlust, hatte jedoch eine minimale Letalität. Trends in der Histologie und den Antigenfärbungsmustern, die wir bei jungen Mäusen beobachteten, wurden bei den älteren Tieren konserviert ( Ergänzende Tabelle 3 ). Wir haben die Möglichkeit ausgeschlossen, dass SHC014-MA15 eine Infektion durch einen alternativen Rezeptor vermittelt, auf der Grundlage von Experimenten mit Ace2 -Mäusen −/− , die nach SHC014-MA15-Infektion keinen Gewichtsverlust oder keine Antigenfärbung zeigten ( Ergänzende Abb. 4a,b und Ergänzung Tabelle 2 ). Zusammengenommen weisen die Daten darauf hin, dass Viren mit dem SHC014-Spike in der Lage sind, im Rahmen eines virulenten CoV-Rückgrats bei Mäusen Gewichtsverlust zu bewirken.
Angesichts der präklinischen Wirksamkeit von monoklonalen Ebola-Antikörpertherapien wie ZMApp 10 versuchten wir als nächstes, die Wirksamkeit monoklonaler SARS-CoV-Antikörper gegen eine Infektion mit SHC014-MA15 zu bestimmen. Vier weitgehend neutralisierende humane monoklonale Antikörper, die auf das SARS-CoV-Spike-Protein abzielen, wurden zuvor berichtet und sind wahrscheinliche Reagenzien für die Immuntherapie 11 , 12 , 13 . Wir untersuchten die Wirkung dieser Antikörper auf die Virusreplikation (ausgedrückt als prozentuale Hemmung der Virusreplikation) und stellten fest, dass SARS-CoV Urbani vom Wildtyp bei relativ niedrigen Antikörperkonzentrationen durch alle vier Antikörper stark neutralisiert wurde ( Abb. 2a–d ), Neutralisation variierte für SHC014-MA15. Fm6, ein Antikörper, der durch Phagen-Display und Escape-Mutanten 11 , 12 erzeugt wurde , erreichte nur Hintergrundniveaus der Hemmung der SHC014-MA15-Replikation ( 2a ). In ähnlicher Weise konnten die Antikörper 230.15 und 227.14, die aus Gedächtnis-B-Zellen von SARS-CoV-infizierten Patienten 13 stammten, auch die SHC014-MA15-Replikation nicht blockieren ( 2b,c ). Bei allen drei Antikörpern entsprachen die Unterschiede zwischen den SARS- und SHC014-Spike-Aminosäuresequenzen direkten oder benachbarten Restveränderungen, die in SARS-CoV-Escape-Mutanten gefunden wurden (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), was wahrscheinlich das Fehlen der Antikörper erklärt explains ' neutralisierende Aktivität gegen SHC014. Schließlich konnte der monoklonale Antikörper 109.8 eine 50%ige Neutralisation von SHC014-MA15 erreichen, jedoch nur bei hohen Konzentrationen (10 μg/ml) ( 2d ). Zusammen zeigen die Ergebnisse, dass breit neutralisierende Antikörper gegen SARS-CoV möglicherweise nur eine geringe Wirksamkeit gegen neu auftretende SARS-ähnliche CoV-Stämme wie SHC014 haben.
Abbildung 2: Monoklonale SARS-CoV-Antikörper haben eine marginale Wirksamkeit gegen SARS-ähnliche CoVs.
Figur 2
( a – d ) Neutralisationsassays zur Bewertung der Wirksamkeit (gemessen als Reduktion der Anzahl von Plaques) eines Panels monoklonaler Antikörper, die alle ursprünglich gegen das epidemische SARS-CoV erzeugt wurden, gegen die Infektion von Vero-Zellen mit SARS-CoV Urbani (schwarz) oder SHC014-MA15 (grün). Die getesteten Antikörper waren fm6 ( n = 3 für Urbani; n = 5 für SHC014-MA15) 11 , 12 ( a ), 230,15 ( n = 3 für Urbani; n = 2 für SHC014-MA15) ( b ), 227,15 ( n = 3 für Urbani; n = 5 für SHC014-MA15) ( c ) und 109,8 ( n = 3 für Urbani; n = 2 für SHC014-MA15) 13 ( d ). Jeder Datenpunkt stellt den Gruppenmittelwert dar und Fehlerbalken definieren das sem Beachten Sie, dass die Fehlerbalken in SARS-CoV Urbani-infizierten Vero-Zellen in b , c von den Symbolen überlagert und nicht sichtbar sind.
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Um die Wirksamkeit bestehender Impfstoffe gegen eine Infektion mit SHC014-MA15 zu bewerten, haben wir alte Mäuse mit doppelt inaktiviertem SARS-CoV (DIV) geimpft. Frühere Arbeiten zeigten, dass DIV junge Mäuse neutralisieren und vor der Herausforderung mit einem homologen Virus schützen kann 14 ; Der Impfstoff schützte jedoch ältere Tiere, bei denen auch eine verstärkte Immunpathologie beobachtet wurde, nicht, was auf die Möglichkeit hindeutet, dass die Tiere durch die Impfung geschädigt werden 15 . Hier fanden wir, dass DIV keinen Schutz vor einer Herausforderung mit SHC014-MA15 in Bezug auf Gewichtsverlust oder Virustiter bot ( Ergänzende Fig. 5a, b ). In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht mit anderen heterologen CoVs der Gruppe 2b 15 konnte auch Serum von DIV-geimpften, gealterten Mäusen SHC014-MA15 nicht neutralisieren ( ergänzende Fig. 5c ). Insbesondere führte die DIV-Impfung zu einer robusten Immunpathologie ( Ergänzende Tabelle 4 ) und Eosinophilie ( Ergänzende Abb. 5d–f ). Zusammen bestätigen diese Ergebnisse, dass der DIV-Impfstoff keinen Schutz gegen eine Infektion mit SHC014 bietet und möglicherweise die Krankheit in der geimpften Altersgruppe verstärken könnte.
Im Gegensatz zur Impfung von Mäusen mit DIV zeigte die Verwendung von SHC014-MA15 als abgeschwächter Lebendimpfstoff einen möglichen Kreuzschutz gegen eine Infektion mit SARS-CoV, aber die Ergebnisse weisen wichtige Vorbehalte auf. Wir infizierten junge Mäuse mit 10 4 pfu SHC014-MA15 und beobachteten sie 28 d lang. Wir haben die Mäuse dann am Tag 29 mit SARS-MA15 herausgefordert ( Ergänzende Fig. 6a ). Die vorherige Infektion der Mäuse mit der hohen Dosis von SHC014-MA15 vermittelte Schutz vor einer Infektion mit einer tödlichen Dosis von SARS-MA15, obwohl es nur eine minimale SARS-CoV-Neutralisierungsreaktion von den Antiseren gab, die 28 Tage nach der SHC014-MA15-Infektion ausgelöst wurde ( Ergänzende Abb. 6b , 1:200). In Abwesenheit eines sekundären Antigen-Boosts stellen 28 dpi den erwarteten Höchstwert der Antikörpertiter dar und implizieren, dass der Schutz gegen SARS-CoV im Laufe der Zeit verringert wird 16 , 17 . Ähnliche Ergebnisse, die einen Schutz gegen eine Infektion mit einer tödlichen Dosis von SARS-CoV zeigten, wurden bei gealterten BALB/c-Mäusen in Bezug auf Gewichtsverlust und Virusreplikation beobachtet ( ergänzende Fig. 6c, d ). Jedoch die SHC014-MA15-Infektionsdosis von 10 4 induzierte pfu > 10 % Gewichtsverlust und Letalität bei einigen alten Tieren ( 1 und ergänzende 3 ). Wir fanden, dass die Impfung mit einer niedrigeren Dosis von SHC014-MA15 (100 pfu) keinen Gewichtsverlust induziert, aber auch alte Tiere nicht vor einer tödlichen Dosisbelastung durch SARS-MA15 schützt ( Ergänzende Fig. 6e,f ). Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass die SHC014-MA15-Herausforderung durch konservierte Epitope einen Kreuzschutz gegen SARS-CoV verleihen kann, aber die erforderliche Dosis induziert die Pathogenese und schließt die Verwendung als abgeschwächter Impfstoff aus.
Nachdem wir festgestellt hatten, dass der SHC014-Spike die Fähigkeit besitzt, eine Infektion menschlicher Zellen zu vermitteln und Krankheiten bei Mäusen zu verursachen, synthetisierten wir als nächstes einen infektiösen SHC014-CoV-Klon in voller Länge basierend auf dem für SARS-CoV verwendeten Ansatz ( 3a ) 2 . Die Replikation in Vero-Zellen zeigte kein Defizit für SHC014-CoV im Vergleich zu dem für SARS-CoV ( 3b ); SHC014-CoV war jedoch signifikant ( p in primären HAE-Kulturen sowohl 24 als auch 48 h nach der Infektion < 0,01) abgeschwächt ( 3c ). Die In-vivo- Infektion von Mäusen zeigte keinen signifikanten Gewichtsverlust, zeigte jedoch eine reduzierte Virusreplikation in den Lungen einer SHC014-CoV-Infektion voller Länge im Vergleich zu SARS-CoV Urbani ( 3d , e ). Zusammen belegen die Ergebnisse die Lebensfähigkeit von SHC014-CoV voller Länge, legen jedoch nahe, dass eine weitere Anpassung erforderlich ist, damit seine Replikation der von epidemischem SARS-CoV in menschlichen Atemwegszellen und in Mäusen entspricht.
Abbildung 3: SHC014-CoV in voller Länge repliziert in menschlichen Atemwegen, aber es fehlt die Virulenz des epidemischen SARS-CoV.
Figur 3
( a ) Schema des molekularen Klons SHC014-CoV, der als sechs zusammenhängende cDNAs (bezeichnet als SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E und SHC014F) synthetisiert wurde, flankiert von einzigartigen BglI-Stellen, die den gerichteten Zusammenbau der cDNA in voller Länge ermöglichten offene Leseraster (für 1a, 1b, Spike, 3, Hülle, Matrix, 6–8 und Nukleokapsid). Unterstrichene Nukleotide stellen die Überhangsequenzen dar, die nach der Spaltung mit Restriktionsenzymen gebildet wurden. ( b , c ) Virale Replikation von SARS-CoV Urbani (schwarz) oder SHC014-CoV (grün) nach Infektion von Vero-Zellen ( b ) oder gut differenzierten, primären HAE-Zellkulturen mit Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ( c ) bei einer MOI von 0,01. Proben wurden zu einzelnen Zeitpunkten mit biologischen Replikaten ( gesammelt n = 3) für jede Gruppe . Die Daten repräsentieren ein Experiment sowohl für Vero- als auch für HAE-Zellen. ( d , e ) Gewichtsverlust ( n = 3 für SARS-CoV MA15, n = 7 für SHC014-CoV; n = 6 für SARS-Urbani) ( d ) und Virusreplikation in der Lunge ( n = 3 für SARS-Urbani und SHC014-CoV) ( e ) von 10 Wochen alten BALB/c-Mäusen, die mit 1 × 10 5 pfu SARS-CoV MA15 (grau), SHC014-CoV (grün) oder SARS-CoV Urbani (schwarz) über die auf der Route. Jeder Datenpunkt stellt den Gruppenmittelwert dar, und Fehlerbalken definieren die sem ** P < 0,01 und *** P < 0,001 unter Verwendung des zweiseitigen Student- t- Tests einzelner Zeitpunkte.
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Während der SARS-CoV-Epidemie wurden schnell Verbindungen zwischen Palmzibets und den beim Menschen nachgewiesenen CoV-Stämmen hergestellt 4 . Aufbauend auf diesem Befund argumentiert das gemeinsame Emergenz-Paradigma, dass das epidemische SARS-CoV als Fledermausvirus entstanden ist, auf Zibetkatzen übersprang und Veränderungen innerhalb der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) eingebaut hat, um die Bindung an Zibetkatze Ace2 zu verbessern (Ref. 18 ). Die anschließende Exposition gegenüber Menschen auf Märkten für lebende Tiere ermöglichte eine Ansteckung des Menschen mit dem Zibet-Stamm, der sich wiederum zum epidemischen Stamm adaptierte ( Abb. 4a ). Die phylogenetische Analyse legt jedoch nahe, dass frühe humane SARS-Stämme enger mit Fledermausstämmen als mit Zibet-Stämmen verwandt zu sein scheinen 18 . Daher argumentiert ein zweites Paradigma, dass die direkte Übertragung von Fledermäusen auf den Menschen das Auftreten von SARS-CoV initiierte und dass Zibetkatzen als sekundärer Wirt und Reservoir für eine fortgesetzte Infektion dienten ( Abb. 4b ) 19 . Für beide Paradigmen wird die Spike-Adaption in einem sekundären Wirt als eine Notwendigkeit angesehen, wobei erwartet wird, dass die meisten Mutationen innerhalb der RBD auftreten, wodurch eine verbesserte Infektion erleichtert wird. Beide Theorien implizieren, dass die Pools von Fledermaus-CoVs begrenzt sind und dass Mutationen im Wirtsbereich sowohl zufällig als auch selten sind, was die Wahrscheinlichkeit zukünftiger Emergenzereignisse beim Menschen verringert.
Abbildung 4: Emergenzparadigmen für Coronaviren.
Figur 4
Coronavirus-Stämme werden in Quasi-Spezies-Pools gehalten, die in Fledermauspopulationen zirkulieren. ( a , b ) Traditionelle SARS-CoV-Entstehungstheorien gehen davon aus, dass Mutanten im Wirtsbereich (roter Kreis) zufällige und seltene Vorkommnisse darstellen, die eine Infektion alternativer Wirte ermöglichen. Das Sekundärwirt-Paradigma ( a ) argumentiert, dass ein nichtmenschlicher Wirt mit einem Fledermaus-Vorläufervirus infiziert wird und durch Anpassung die Übertragung auf den Menschen erleichtert; die anschließende Replikation beim Menschen führt zum epidemischen Virusstamm. Das direkte Paradigma ( b ) legt nahe, dass die Übertragung zwischen Fledermäusen und Menschen erfolgt, ohne dass ein Zwischenwirt erforderlich ist; Die Selektion erfolgt dann in der menschlichen Population mit eng verwandten Viren, die sich in einem sekundären Wirt replizieren, was eine fortgesetzte virale Persistenz und Anpassung in beiden ermöglicht. ( c ) Die Daten von chimären SARS-ähnlichen Viren argumentieren, dass die Quasi-Spezies-Pools mehrere Viren enthalten, die in der Lage sind, menschliche Zellen zu infizieren, ohne dass Mutationen erforderlich sind (rote Kreise). Obwohl für das Auftreten einer Epidemie Anpassungen bei sekundären oder menschlichen Wirten erforderlich sein können, kann es beim Menschen zu einer epidemischen Erkrankung kommen, wenn SHC014-Spike-enthaltende Viren mit virulenten CoV-Rückgraten (grünen Kreisen) rekombinieren. Bestehende Daten unterstützen Elemente aller drei Paradigmen.
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Obwohl unsere Studie die anderen Emergenzrouten nicht entkräftet, spricht sie für ein drittes Paradigma, in dem zirkulierende Fledermaus-CoV-Pools „ausgeglichene“ Spike-Proteine enthalten, die Menschen ohne Mutation oder Anpassung infizieren können ( Abb. 4c ). Diese Hypothese wird durch die Fähigkeit eines chimären Virus, das den SHC014-Spike in einem SARS-CoV-Rückgrat enthält, veranschaulicht, eine robuste Infektion sowohl in menschlichen Atemwegskulturen als auch in Mäusen ohne RBD-Anpassung zu verursachen. In Verbindung mit der Beobachtung zuvor identifizierter pathogener CoV-Rückgrate 3 , 20 legen unsere Ergebnisse nahe, dass die Ausgangsmaterialien, die für SARS-ähnliche emergente Stämme erforderlich sind, derzeit in Tierreservoirs zirkulieren. Obwohl SHC014-CoV in voller Länge wahrscheinlich eine zusätzliche Anpassung des Rückgrats erfordert, um menschliche Krankheiten zu vermitteln, unterstreichen die dokumentierten hochfrequenten Rekombinationsereignisse in CoV-Familien die Möglichkeit eines zukünftigen Auftretens und die Notwendigkeit einer weiteren Vorbereitung.
Bisher wurden genomische Screenings von Tierpopulationen hauptsächlich verwendet, um neue Viren in Ausbruchssituationen zu identifizieren 21 . Der hier vorgestellte Ansatz erweitert diese Datensätze, um Fragen der viralen Entstehung und therapeutischen Wirksamkeit zu untersuchen. Wir betrachten Viren mit dem SHC014-Spike als potenzielle Bedrohung aufgrund ihrer Fähigkeit, sich in primären menschlichen Atemwegskulturen zu replizieren, dem besten verfügbaren Modell für menschliche Krankheiten. Darüber hinaus weist die beobachtete Pathogenese bei Mäusen auf die Fähigkeit von SHC014-enthaltenden Viren hin, in Säugetiermodellen ohne RBD-Anpassung Krankheiten zu verursachen. Insbesondere der differentielle Tropismus in der Lunge im Vergleich zu SARS-MA15 und die Abschwächung von SHC014-CoV voller Länge in HAE-Kulturen im Vergleich zu SARS-CoV Urbani deuten darauf hin, dass Faktoren jenseits der ACE2-Bindung – einschließlich Spike-Prozessivität, Rezeptorbioverfügbarkeit oder Antagonismus der Immunantworten des Wirts – kann zur Entstehung beitragen. Es sind jedoch weitere Tests an nichtmenschlichen Primaten erforderlich, um diese Ergebnisse in ein pathogenes Potenzial für den Menschen zu übersetzen. Wichtig ist, dass das Versagen verfügbarer Therapeutika einen kritischen Bedarf an weiteren Studien und an der Entwicklung von Behandlungen definiert. Mit diesem Wissen können Überwachungsprogramme, diagnostische Reagenzien und wirksame Behandlungen erstellt werden, die vor dem Auftreten von Gruppe 2b-spezifischen CoVs wie SHC014 schützen, und diese können auf andere CoV-Zweigstellen angewendet werden, die ähnlich heterogene Pools unterhalten.
Dieser Ansatz muss nicht nur gegen zukünftige neu auftretende Viren vorbereitet werden, sondern muss auch im Zusammenhang mit den von der US-Regierung angeordneten Pausen bei Funktionsgewinn-Studien (GOF) 22 betrachtet werden . Auf der Grundlage früherer Emergenzmodelle ( 4a , b ) war nicht zu erwarten, dass die Bildung chimärer Viren wie SHC014-MA15 die Pathogenität erhöht. Obwohl SHC014-MA15 im Vergleich zu seinem parentalen Maus-adaptierten SARS-CoV abgeschwächt ist, zeigten ähnliche Studien, die die Pathogenität von CoVs mit dem Wildtyp-Urbani-Spike innerhalb des MA15-Rückgrats untersuchten, keinen Gewichtsverlust bei Mäusen und eine reduzierte Virusreplikation 23 . Somit zeigt SHC014-MA15 gegenüber dem Urbani-Spike-MA15-CoV einen Pathogenesegewinn ( Abb. 1 ). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse könnten wissenschaftliche Gutachtergremien ähnliche Studien zum Aufbau chimärer Viren basierend auf zirkulierenden Stämmen für zu riskant halten, da eine erhöhte Pathogenität in Säugetiermodellen nicht ausgeschlossen werden kann. In Verbindung mit Beschränkungen für Maus-adaptierte Stämme und der Entwicklung monoklonaler Antikörper unter Verwendung von Escape-Mutanten könnte die Erforschung des Auftretens von CoV und der therapeutischen Wirksamkeit in Zukunft stark eingeschränkt sein. Zusammengenommen stellen diese Daten und Einschränkungen eine Kreuzung der GOF-Forschungsanliegen dar; Das Potenzial zur Vorbereitung und Eindämmung künftiger Ausbrüche muss gegen das Risiko der Entstehung gefährlicherer Krankheitserreger abgewogen werden. Bei der Entwicklung von Strategien für die Zukunft ist es wichtig, den Wert der durch diese Studien gewonnenen Daten zu berücksichtigen und zu berücksichtigen, ob diese Arten von Studien mit chimären Viren im Vergleich zu den damit verbundenen Risiken weitere Untersuchungen rechtfertigen.
Insgesamt hat unser Ansatz Metagenomikdaten verwendet, um eine potenzielle Bedrohung durch das zirkulierende SARS-ähnliche CoV SHC014 der Fledermaus zu identifizieren. Aufgrund der Fähigkeit chimärer SHC014-Viren, sich in menschlichen Atemwegskulturen zu replizieren, eine Pathogenese in vivo zu verursachen und aktuellen Therapeutika zu entgehen, besteht ein Bedarf sowohl an einer Überwachung als auch an verbesserten Therapeutika gegen zirkulierende SARS-ähnliche Viren. Unser Ansatz erschließt auch die Nutzung von Metagenomik-Daten, um das Auftreten von Viren vorherzusagen und dieses Wissen bei der Vorbereitung der Behandlung zukünftiger neu auftretender Virusinfektionen anzuwenden.
Methoden
Viren, Zellen, In-vitro- Infektion und Plaque-Assays.
Wildtyp-SARS-CoV (Urbani), Maus-adaptiertes SARS-CoV (MA15) und chimäre SARS-ähnliche CoVs wurden auf Vero E6-Zellen (erhalten vom Medical Research Institute of Infectious Diseases der US-Armee) kultiviert, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle's gezüchtet wurden Medium (DMEM) (Gibco, CA) und 5% fötales Klonserum (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) zusammen mit Antibiotikum/Antimykotikum (Gibco, Carlsbad, CA). DBT-Zellen (Baric Laboratory, Quelle unbekannt), die ACE2- exprimieren Orthologe , wurden zuvor sowohl für den Menschen als auch für die Zibetkatze beschrieben; bitte Ace2 Sequenz wurde auf dem von Grundlage Rhinolophus leschenaulti und DBT Zellen exprimieren bittet Ace2 wurden etabliert wie zuvor beschrieben 8 . Pseudotypisierungsexperimente waren ähnlich denen unter Verwendung eines HIV-basierten Pseudovirus, hergestellt wie zuvor beschrieben 10 und an HeLa-Zellen (Wuhan Institute of Virology) untersucht, die exprimierten ACE2- Orthologe . HeLa-Zellen wurden in minimalem essentiellem Medium (MEM) (Gibco, CA), ergänzt mit 10 % FCS (Gibco, CA), wie zuvor beschrieben gezüchtet 24 . Wachstumskurven in Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 und primären menschlichen Atemwegsepithelzellen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt 8 , 25 . Keiner der Arbeitszelllinienbestände wurde kürzlich authentifiziert oder auf Mykoplasmen getestet, obwohl die ursprünglichen Samenbestände, die zur Herstellung der Arbeitsbestände verwendet wurden, frei von Kontaminationen sind. Menschliche Lungen für HAE-Kulturen wurden im Rahmen der von der University of North Carolina at Chapel Hill Institutional Review Board genehmigten Protokolle beschafft. HAE-Kulturen repräsentieren hochdifferenziertes humanes Atemwegsepithel, das Flimmer- und Nicht-Flimmerepithelzellen sowie Becherzellen enthält. Die Kulturen werden auch vor der Verwendung mehrere Wochen auf einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet, wie zuvor beschrieben 26 . Kurz gesagt wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Virus beimpft oder in PBS für 40 Minuten bei 37 °C scheinverdünnt. Nach der Inokulation wurden die Zellen dreimal gewaschen und frisches Medium wurde zugegeben, um den Zeitpunkt '0' anzuzeigen. Zu jedem beschriebenen Zeitpunkt wurden drei oder mehr biologische Replikate geerntet. In keiner Probensammlung wurde eine Verblindung verwendet, noch wurden die Proben randomisiert. Die gesamte Viruskultivierung wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe (BSL) 3 mit redundanten Ventilatoren in den Biosicherheitswerkbänken durchgeführt, wie zuvor von unserer Gruppe 2 beschrieben . Alle Mitarbeiter trugen luftreinigende Atemschutzmasken (Breathe Easy, 3M) mit Tyvek-Anzügen, Schürzen und Stiefeletten und trugen Doppelhandschuhe.
Sequenzclustering und strukturelle Modellierung.
Die genomischen Sequenzen in voller Länge und die Aminosäuresequenzen der S1-Domänen des Spikes repräsentativer CoVs wurden von der Genbank oder dem Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC) heruntergeladen, mit ClustalX abgeglichen und phylogenetisch unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Schätzung mit 100 Bootstraps oder durch mit dem PhyML ( https://code.google.com/p/phyml/ Paket ). Der Baum wurde unter Verwendung der maximalen Wahrscheinlichkeit mit dem PhyML-Paket generiert. Der Maßstabsbalken repräsentiert Nukleotid-Substitutionen. Nur Knoten mit Bootstrap-Unterstützung über 70 % werden gekennzeichnet. Der Baum zeigt, dass CoVs in drei verschiedene phylogenetische Gruppen unterteilt sind, die als α-CoVs, β-CoVs und γ-CoVs definiert sind. Klassische Untergruppencluster sind mit 2a, 2b, 2c und 2d für β-CoVs und 1a und 1b für die α-CoVs gekennzeichnet. Strukturmodelle wurden mit Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) generiert, um Homologiemodelle für SHC014 und Rs3367 der SARS RBD im Komplex mit ACE2 basierend auf der Kristallstruktur zu generieren 2AJF (Protein Data Bank) . Homologiemodelle wurden in MacPyMol (Version 1.3) visualisiert und manipuliert.
Konstruktion von SARS-ähnlichen chimären Viren.
Sowohl Wildtyp- als auch chimäre Viren wurden entweder von SARS-CoV Urbani oder dem entsprechenden Maus-adaptierten (SARS-CoV MA15) infektiösen Klon (ic) wie zuvor beschrieben 27 abgeleitet . Plasmide, die Spike-Sequenzen für SHC014 enthielten, wurden durch Restriktionsverdau extrahiert und in das E- und F-Plasmid des infektiösen Klons MA15 ligiert. Der Klon wurde von Bio Basic als sechs zusammenhängende cDNAs entworfen und gekauft, wobei veröffentlichte Sequenzen verwendet wurden, die von einzigartigen Klasse-II-Restriktionsendonuklease-Stellen (BglI) flankiert wurden. Danach wurden Plasmide, die Wildtyp-, chimäre SARS-CoV- und SHC014-CoV-Genomfragmente enthielten, amplifiziert, ausgeschnitten, ligiert und gereinigt. In-vitro- Transkriptionsreaktionen wurden dann durchgeführt, um genomische RNA voller Länge zu synthetisieren, die wie zuvor beschrieben in Vero-E6-Zellen transfiziert wurde 2 . Das Medium von transfizierten Zellen wurde geerntet und diente als Saatvorräte für nachfolgende Experimente. Chimäre und Volllängenviren wurden durch Sequenzanalyse vor der Verwendung in diesen Studien bestätigt. Die synthetische Konstruktion der chimären Mutante und des SHC014-CoV in voller Länge wurde vom Institutional Biosafety Committee der University of North Carolina und dem Dual Use Research of Concern Committee genehmigt.
Ethik-Erklärung.
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Pflege und Verwendung von Tieren des Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW), NIH, durchgeführt. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of North Carolina in Chapel Hill (UNC, Permit Number A-3410-01) genehmigte das in diesen Studien verwendete Tierstudienprotokoll (IACUC #13-033).
Mäuse und In-vivo- Infektion.
Weibliche, 10 Wochen alte und 12 Monate alte BALB/cAnNHsD-Mäuse wurden von Harlan Laboratories bestellt. Mausinfektionen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt 20 . Kurz gesagt wurden die Tiere in ein BSL3-Labor gebracht und 1 Woche vor der Infektion akklimatisieren gelassen. Für die Infektion und die Lebend-attenuierte Virusimpfung wurden Mäuse mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin anästhesiert und intranasal infiziert, wenn sie herausgefordert wurden, mit 50 μl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder verdünntem Virus mit drei oder vier Mäusen pro Zeitpunkt, per Infektionsgruppe pro Dosis wie in den Abbildungslegenden beschrieben. Bei einzelnen Mäusen können Hinweise auf eine Infektion, einschließlich Nichtinhalieren der gesamten Dosis, Blasen des Inokulums aus der Nase oder Infektion durch den Mund, nach Ermessen des Forschers zum Ausschluss von Mausdaten geführt haben; nach der Infektion werden keine anderen vorab festgelegten Ausschluss- oder Einschlusskriterien definiert. In keinem Tierversuch wurde verblindet, und die Tiere wurden nicht randomisiert. Zur Impfung wurden junge und alte Mäuse durch Fußballeninjektion mit einem 20-μl-Volumen von entweder 0,2 μg doppelt inaktiviertem SARS-CoV-Impfstoff mit Alaun oder PBS-Mock geimpft; Mäuse wurden dann 22 Tage später mit dem gleichen Regime geboostert und 21 Tage danach gereizt. Für alle Gruppen wurden die Tiere gemäß Protokoll während der Dauer des Experiments täglich auf klinische Krankheitszeichen (Bückchen, zerzaustes Fell und reduzierte Aktivität) überwacht. Der Gewichtsverlust wurde in den ersten 7 Tagen täglich überwacht, wonach die Gewichtsüberwachung fortgesetzt wurde, bis die Tiere ihr ursprüngliches Ausgangsgewicht wieder erreichten oder 3 Tage lang eine kontinuierliche Gewichtszunahme aufwiesen. Alle Mäuse, die mehr als 20 % ihres anfänglichen Körpergewichts verloren, wurden mit Boden gefüttert und mehrmals täglich weiter überwacht, solange sie unter dem Grenzwert von 20 % lagen. Mäuse, die mehr als 30% ihres anfänglichen Körpergewichts verloren, wurden sofort gemäß Protokoll getötet. Jede Maus, von der angenommen wurde, dass sie im Sterben liegt oder sich wahrscheinlich nicht erholt, wurde nach Ermessen des Forschers auch auf humane Weise getötet. Euthanasie wurde mit einer Isofluran-Überdosis durchgeführt und der Tod wurde durch zervikale Luxation bestätigt. Alle Mausstudien wurden an der University of North Carolina (Animal Welfare Assurance #A3410-01) unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden.
Histologische Analyse.
Die linke Lunge wurde entfernt und in 10% gepuffertem Formalin (Fisher) ohne Inflation für 1 Woche eingetaucht. Die Gewebe wurden in Paraffin eingebettet und 5-μm-Schnitte wurden von der Histopathologie-Kerneinrichtung des UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center hergestellt. Um das Ausmaß der Antigenfärbung zu bestimmen, wurden Schnitte auf virales Antigen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen polyklonalen SARS-CoV-Anti-Nukleokapsid-Antikörpers (Imgenex) gefärbt und blind durch die Färbung der Atemwege und des Parenchyms wie zuvor beschrieben bewertet 20 . Die Bilder wurden mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit einer Olympus DP71 Kamera aufgenommen.
Virusneutralisationsassays.
Plaque-Reduktions-Neutralisationstiter-Assays wurden mit zuvor charakterisierten Antikörpern gegen SARS-CoV durchgeführt, wie zuvor beschrieben 11 , 12 , 13 . Kurz gesagt, neutralisierende Antikörper oder Serum wurden seriell zweifach verdünnt und mit 100 pfu der verschiedenen SARS-CoV-Stämme des infektiösen Klons 1 h bei 37 °C inkubiert. Das Virus und die Antikörper wurden dann auf eine 6-Well-Platte mit 5 × 10 5 Vero E6-Zellen/Well mit mehreren Replikaten ( n 2) gegeben. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen mit 3 ml 0,8% Agarose in Medium überschichtet. Die Platten wurden 2 Tage bei 37 °C inkubiert, 3 Stunden mit Neutralrot gefärbt und die Plaques wurden gezählt. Der Prozentsatz der Plaque-Reduktion wurde berechnet als (1 – (Anzahl Plaques mit Antikörper/Anzahl Plaques ohne Antikörper)) × 100.
Statistische Analyse.
Alle Experimente wurden gegen zwei experimentelle Gruppen (entweder zwei Viren oder geimpfte und ungeimpfte Kohorten) durchgeführt. Daher wurden signifikante Unterschiede im viralen Titer und in der Histologiebewertung durch einen zweiseitigen Student- t- Test zu einzelnen Zeitpunkten bestimmt. Die Daten waren in jeder verglichenen Gruppe normal verteilt und wiesen eine ähnliche Varianz auf.
Biosicherheit und Biosicherheit.
Die gemeldeten Studien wurden eingeleitet, nachdem das Institutional Biosafety Committee der University of North Carolina das experimentelle Protokoll genehmigt hatte (Projekttitel: Generierung infektiöser Klone von SARS-ähnlichen CoVs von Fledermäusen; Lab Safety Plan ID: 20145741; Schedule G ID: 12279). Diese Studien wurden eingeleitet, bevor die Finanzierung des Deliberative Process Research der US-Regierung über ausgewählte Forschungsergebnisse zum Funktionsgewinn mit Influenza-, MERS- und SARS-Viren ( http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function .pdf ). Dieses Papier wurde von der Förderagentur NIH überprüft. Die Fortsetzung dieser Studien wurde beantragt, und dies wurde von der NIH genehmigt.
SARS-CoV ist ein ausgewählter Agent. Alle Arbeiten für diese Studien wurden mit genehmigten Standardarbeitsanweisungen (SOPs) und Sicherheitsbedingungen für SARS-CoV, MERs-CoV und andere verwandte CoVs durchgeführt. Unsere institutionellen CoV BSL3-Einrichtungen wurden so konzipiert, dass sie den Sicherheitsanforderungen entsprechen, die vom Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), dem US-Gesundheitsministerium, dem Public Health Service, den Centers for Disease Control (CDC .) empfohlen werden ) und die NIH. Laborsicherheitspläne wurden dem UNC Department of Environmental Health and Safety (EHS) und der CDC vorgelegt und die Einrichtung wurde zur Nutzung genehmigt. Für den Zutritt zur Einrichtung ist eine elektronische Zugangskarte erforderlich. Alle Arbeiter wurden von EHS in der sicheren Verwendung von luftreinigenden Atemschutzgeräten (PAPRs) geschult, und es gibt angemessene Arbeitsgewohnheiten in einer BSL3-Einrichtung und aktive medizinische Überwachungspläne. Unsere CoV BSL3-Einrichtungen enthalten redundante Lüfter, Notstrom für Lüfter und biologische Sicherheitsschränke und Gefrierschränke, und unsere Einrichtungen können SealSafe-Maus-Racks aufnehmen. Als BSL3-Erreger klassifizierte Materialien bestehen aus SARS-CoV, Fledermaus-CoV-Vorläuferstämmen, MERS-CoV und von diesen Erregern abgeleiteten Mutanten. Innerhalb der BSL3-Einrichtungen werden Experimente mit infektiösen Viren in einem zertifizierten Biosafety Cabinet (BSC) der Klasse II durchgeführt. Alle Mitarbeiter tragen Kittel, Tyvek-Anzüge und -Schürzen, PAPRs und Überschuhe, und ihre Hände sind doppelt behandschuht. BSL3-Benutzer unterliegen einem medizinischen Überwachungsplan, der von der University Employee Occupational Health Clinic (UEOHC) überwacht wird, der eine jährliche körperliche, jährliche Influenza-Impfung und eine obligatorische Meldung von Symptomen im Zusammenhang mit einer CoV-Infektion während der Arbeitszeiten in der BSL3 umfasst. Alle BSL3-Anwender sind in Expositionsmanagement und Meldeprotokollen geschult, sind auf die Selbstquarantäne vorbereitet und wurden für die sichere Lieferung an eine lokale Abteilung für Infektionskrankheitenmanagement in einer Notfallsituation geschult. Alle potenziellen Expositionsereignisse werden von EHS und UEOHC gemeldet und untersucht, wobei Berichte sowohl bei der CDC als auch bei der NIH eingereicht werden.
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